Síntese convergente de oligonucleotídeos fosforodiamidato morfolino (PMOs) pelo H

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12576 (2023) Citar este artigo

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Os oligonucleotídeos morfolino fosforodiamidato (PMOs) são um tipo promissor de oligonucleotídeos antisense, mas sua síntese desafiadora os torna de difícil acesso. Esta pesquisa apresenta uma abordagem sintética eficiente para PMOs utilizando a abordagem H-fosfonato. O uso de reagentes de condensação do tipo fosfônio reduziu significativamente os tempos de acoplamento em comparação com a abordagem sintética atual. Além disso, os reagentes de condensação do tipo fosfônio facilitaram a condensação do fragmento do PMO, sintetizando até 8-meros contendo todas as quatro nucleobases com notável eficácia de acoplamento. Este é o primeiro relatório sobre a síntese convergente de PMOs. Esta abordagem facilitaria a síntese em larga escala de PMOs e aceleraria a sua popularidade e acessibilidade como terapia de próxima geração.

A abordagem antisense atraiu a atenção dos pesquisadores como uma potencial terapia futura para controlar a expressão de genes relacionados a doenças1,2,3. Oligonucleotídeos morfolino fosforodiamidato (PMOs), com ligações internucleotídicas não iônicas e uma estrutura morfolino, são considerados medicamentos antisense promissores . A alta afinidade de ligação ao mRNA4 alvo, especificidade de sequência6,7, solubilidade em água6 e baixa toxicidade do PMO7,8,9,10 foram confirmadas em estudos anteriores. Até o momento, quatro medicamentos antisense para a distrofia muscular de Duchenne foram aprovados (Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14) e espera-se que mais medicamentos PMO sejam aprovados no futuro. Além disso, um novo análogo de PMO denominado oligonucleotídeos tiofosforamidato morfolino (TMOs) foi sintetizado e mostrou potencial como um novo candidato a medicamento na terapia antisense . Os rápidos avanços nos PMOs aumentaram a necessidade de desenvolvimento de abordagens eficientes para a síntese de PMOs e análogos de PMOs. Particularmente, a abordagem sintética, que pode sintetizar PMOs em larga escala de uma só vez, é necessária para a disponibilidade de terapia antisense aos pacientes. Até o momento, muitas abordagens sintéticas foram desenvolvidas. A primeira abordagem sintética para PMOs foi relatada por Summerton e Weller5 (Fig. 1-A). Nesta abordagem, os nucleósidos de morfolino contendo uma porção N, N-dimetilaminoclorofosforamidato no grupo 5'-hidroxi e um grupo tritil (Tr) no grupo amino foram utilizados como unidades monoméricas (A). Os PMOs foram sintetizados repetindo a condensação do grupo 5'-N,N-dimetilaminoclorofosforamidato do monômero (A) com o grupo amino na extremidade 3' do oligômero após remoção do grupo Tr na extremidade 3'5. Esta abordagem é amplamente utilizada, mas tem vários problemas reconhecidos, incluindo baixa reatividade dos monômeros e longos tempos de reação para completar a reação de condensação. Em 2012, Harakawa et al. descobriram que a adição de LiBr a uma mistura de reação era eficaz e resultava em uma aceleração considerável da reação (melhoria de cerca de dez vezes) . Além disso, Li et al.17 descobriram que ao aumentar a temperatura da reação para 90 °C, a reação de condensação foi concluída em 8 min, permitindo-lhes sintetizar um 18mer-PMO em apenas 3,5 h usando um reator de fluxo. Kundu et al.18 relataram a síntese de PMO utilizando oligossintetizador automatizado. Neste relatório, uma síntese em fase de solução de 3-mer PMO foi alcançada usando a química Fmoc. Além disso, PMOs de 30 mer foram sintetizados por um sintetizador de DNA.

Abordagens atuais para a síntese de derivados de PMO.

Recentemente, Langner et al.15 relataram uma nova abordagem sintética para a síntese de TMOs utilizando derivados de fosforodiamidita como monômeros (Fig. 1-B). Em contraste com o PMO, os TMOs possuem ligação fosforotioamidato, que mostrou propriedades promissoras como oligonucleotídeos antisense. Os TMOs mostraram alta afinidade de ligação ao RNA e alta estabilidade de nuclease. Além disso, os TMOs quiméricos exibiram o seu potencial como inibidores de microRNA. 1-B, esta abordagem emprega derivados de morfolino fosforodiamidita contendo um grupo 4,4'-dimetoxitritil (DMTr) no grupo 5'-hidroxi (B) como unidades monoméricas. O processo de síntese envolveu a condensação de um monômero de morfolino fosforodiamidita (B) com o grupo hidroxila na extremidade 5' do oligômero na presença de um ativador ácido, como 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT), seguido de sulfurização de um intermediário fosforamidita (C). A destritilação subsequente seguida por ciclos de síntese repetitivos produziu TMOs. O rendimento de acoplamento relatado foi de 95-97%, com um tempo de reação de condensação de 5 min15. Embora esta abordagem seja eficaz para sintetizar TMOs, não é aplicável à síntese de PMOs. Este método deu o derivado de fosforamidita (C) como intermediário, mas a partir deste intermediário, a ligação fosforodiamidato desejada do PMO não é obtida.